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塑料培養(yǎng)皿的細(xì)胞分離與培養(yǎng)
塑料培養(yǎng)皿細(xì)胞分離對于培養(yǎng)貼壁細(xì)胞至關(guān)重要。胰蛋白酶消化是最流行的分離技術(shù)，盡管它由于對膜和細(xì)胞外基質(zhì)的損害而降低了生存能力。避免這種損害將提高細(xì)胞培養(yǎng)效率。在這里，我們提出了一種無酶細(xì)胞分離方法，該方法利用聲壓從間歇行波中浸入無血清培養(yǎng)基中。與通過胰蛋白酶消化分離的細(xì)胞數(shù)量相比，此方法可分離96.2％的細(xì)胞，并在48小時內(nèi)將其轉(zhuǎn)移產(chǎn)率提高至傳統(tǒng)方法的130％。我們顯示消除胰蛋白酶消化減少了細(xì)胞損傷，提高了分離細(xì)胞的存活率。施加到細(xì)胞的聲壓和間歇行波引起的介質(zhì)晃動被認(rèn)為是導(dǎo)致細(xì)胞脫離的最重要因素。該擬議的方法將通過更有效的轉(zhuǎn)移過程加快組織培養(yǎng)細(xì)胞的擴(kuò)增，從而改善生物制藥生產(chǎn)。
細(xì)胞培養(yǎng)是許多生物技術(shù)應(yīng)用的基礎(chǔ)，包括生物藥物的生產(chǎn)，生物蛋白質(zhì)，組織工程和基因轉(zhuǎn)染。目前，約70％的生物藥物的開發(fā)都涉及哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)程序。藥品管道中生物藥品的數(shù)量正在迅速增加，并且在接下來的幾十年中，對生物藥品的需求預(yù)計還將增加。此外，對干細(xì)胞的研究，例如誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，導(dǎo)致它們在過去幾年中在組織工程中的臨床應(yīng)用。這些努力突顯了對有效培養(yǎng)和提供大量這些細(xì)胞的日益增長的需求。
一種潛在的細(xì)胞分離方法是在細(xì)胞培養(yǎng)表面上使用溫度響應(yīng)性聚合物。當(dāng)溫度降低時，這些表面會迅速水合，變成親水性并引起自發(fā)的細(xì)胞釋放。該方法已經(jīng)用于產(chǎn)生細(xì)胞片和組織。但是，該方法的主要缺點(diǎn)是必須在培養(yǎng)表面上使用溫度敏感的聚合物，該聚合物既昂貴又易于意外或過早釋放。此外，該方法需要受過訓(xùn)練的熟練技術(shù)人員來使用它，這增加了成本 最后，由于這些材料需要大量處理以增強(qiáng)細(xì)胞粘附力和處理精度，因此到目前為止，它們尚未用于自動化細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中。有效且無損傷的細(xì)胞分離問題仍然存在。
在這里，我們展示了一種無酶細(xì)胞分離方法，該方法利用了聲壓和由超聲換能器在臨床上普遍存在的細(xì)胞培養(yǎng)皿中形成的間歇性超聲行波引起的晃動。這種方法提供了一種不影響細(xì)胞生存力的細(xì)胞分離方法，因此可用于生物技術(shù)應(yīng)用中的高效細(xì)胞培養(yǎng)。
有效生長培養(yǎng)有兩種細(xì)胞培養(yǎng)方法：單層培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)。傳統(tǒng)上，細(xì)胞是在單層中培養(yǎng)的，其細(xì)胞粘附在平坦的表面上，需要在重新沉積和粘附之前通過酶分離以釋放細(xì)胞：細(xì)胞傳代。懸浮培養(yǎng)方法也已經(jīng)用于研究中，盡管需要仔細(xì)監(jiān)測以控制例如懸浮培養(yǎng)產(chǎn)生的球體的尺寸。需要由于接觸抑制引起的粘附附聚和維持適當(dāng)水平的氧氣,代謝物和信號分子。此外，懸浮培養(yǎng)中每個細(xì)胞所經(jīng)歷的環(huán)境是不同的。球體外部的那些細(xì)胞受到攪動，化學(xué)物質(zhì)快速變化以及營養(yǎng)物質(zhì)流入和廢物提取流量的剪切作用，而球體內(nèi)部的細(xì)胞都缺乏。這些差異導(dǎo)致異質(zhì)性和壞死核心，肯定是代表實(shí)驗(yàn)中實(shí)際組織行為所希望的，但是由于細(xì)胞培養(yǎng)整體質(zhì)量的下降，在大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞中存在問題。
結(jié)果，由于其易于處理，幾十年來，單層細(xì)胞培養(yǎng)一直是主要的方法，需要在塑料培養(yǎng)皿或燒瓶中播種，培養(yǎng)，分離和收集細(xì)胞。盡管其占主導(dǎo)地位，但該方法仍存在重大缺陷，但多年來卻很少有改進(jìn)，特別是在細(xì)胞傳代方面。蛋白酶是一種切斷蛋白質(zhì)中肽鍵的酶，當(dāng)細(xì)胞從塑料培養(yǎng)皿或燒瓶中脫落時，負(fù)責(zé)細(xì)胞表面的破壞。胰蛋白酶是最重要的蛋白酶之一，因?yàn)樗鼜V泛用于分離細(xì)胞的培養(yǎng)中，因此由于其對細(xì)胞膜的破壞而存在問題。流式細(xì)胞儀可用于通過減少細(xì)胞蛋白質(zhì)來檢測這種損傷，這已被證明取決于細(xì)胞浸入胰蛋白酶溶液的時間。長時間的胰蛋白酶治療會延遲第一細(xì)胞分裂，并可能對貼壁細(xì)胞的增殖產(chǎn)生不利影響。胰蛋白酶處理的細(xì)胞可能會恢復(fù)其大多數(shù)表面蛋白，它們通常需要8-24小時才能恢復(fù)，但是胰蛋白酶消化后表達(dá)的某些蛋白是不可逆的。因此，無酶細(xì)胞分離方法對于繼續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)更好。自動化的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)顯示出更高的培養(yǎng)效率，其操縱器可以處理細(xì)胞培養(yǎng)皿和培養(yǎng)瓶以及注射或抽吸溶液。這些自動化系統(tǒng)有助于提高播種，培養(yǎng)和收集過程的效率 ，盡管它們?nèi)匀徊捎靡鹊鞍酌福瑫r使用機(jī)器人進(jìn)行機(jī)器人搖動和移液，仍然會損壞細(xì)胞。如果可能，無酶細(xì)胞分離方法可能會在改善細(xì)胞培養(yǎng)性能和質(zhì)量方面提供實(shí)質(zhì)性的好處。
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